超高效液相色譜檢測血液中的芬太尼類物質和藥物
芬太尼（fentanyl）是一種短效、合成阿片類藥物，于1960年由比利時科學家PaulJanssen首次合成，其鎮痛效果約爲嗎啡的100倍。隨後，PaulJanssen在對芬太尼結構-活性關系進行研究後，開發了一系列芬太尼類似物。由于芬太尼及其類似物鎮痛效果好，且容易獲得，開發不久後就發生了濫用情況，甚至作爲毒品使用。芬太尼類物質通常被掺雜在海洛因等毒品中混合使用，但由于芬太尼類物質存在呼吸抑制等不良反應，大大增加了致死風險。
近幾年，芬太尼類物質的更新速度很快，各種新型芬太尼類物質不斷出現。在20世紀80年代，α-甲基芬太尼和3-甲基芬太尼出現在毒品市場上，此時還出現了一些其他芬太尼類似物，如對-氟芬太尼、β-羟基芬太尼以及麻醉效果極強的卡芬太尼。芬太尼的衍生物3-甲基芬太尼的作用和毒性較海洛因強1000倍，幾毫克即可致命。而卡芬太尼的效能約爲嗎啡的10000倍，是目前世界上最強效的阿片類藥物，規定只能用于大型動物麻醉和制動。2010年後，芬太尼類物質濫用出現新的高峰，乙酰芬太尼、丁酰基芬太尼、β-羟基硫代芬太尼和呋喃芬太尼等多種芬太尼類似物均出現濫用情況。2017年，甲氧乙酰芬太尼和環丙基芬太尼也在案例典型中被檢出。
芬太尼類物質濫用情況嚴重且致死率高，這對各國公共衛生安全造成了嚴重威脅。據統計，2012-2014年美國約7100例與海洛因相關的死亡案例典型中，有41%涉及芬太尼。2015年，美國疾病控制中心報道了近10000例與芬太尼類似物相關的死亡案例典型，比2014年增加了72%。在我國，芬太尼類物質的生產和走私也呈上升趨勢，2016年發現的芬太尼類物質有66份，但在2012—2015年總計僅發現6份。隨着全球範圍特別是北美地區芬太尼及其衍生物濫用導致死亡人數的急劇增加，對于芬太尼類新精神活性物質濫用的鑒定和打擊預防是當前司法鑒定領域的重要任務。目前，我國列管的芬太尼類物質已有25種，超過聯合國列管的21種。在2018年12月1日中美元首會晤後，兩國就禁毒合作達成共識。中方決定對芬太尼類物質進行整類列管，將芬太尼類物質指定爲一種受控物質。
近年來，已有文獻報道在全血、尿樣、毛發、唾液以及幹血點等生物基質中對芬太尼類物質進行分析，分析方法主要爲液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法[28-29]和氣相色譜-串聯質譜（GC-MS/MS）法。但這些方法中多數僅能分析幾種芬太尼類物質，用血量大且耗時長。超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）法能在短時間內實現多種目標物的分離分析。因此，本研究擬采用UPLC-MS/MS法對全血中20種芬太尼類物質進行檢測，旨在建立簡單、快速、靈敏的芬太尼類物質篩選方法，並將其應用于實際案例典型。
芬太尼（fentanyl）、阿芬太尼（alfentanil）、去丙酰基芬太尼［N-phenyl-1-（2-phenylethyl）-4-piperidinamine，4-ANPP］、丙烯酰芬太尼（acrylfentanyl）、丁酰芬太尼（butyrylfentanyl）、異丁酰芬太尼（isobutyrylfentanyl）、3-甲基芬太尼（3-methylfentanyl）、對-氟芬太尼（para-fluorofentanyl）、β-羟基硫代芬太尼（β-hydroxythiofen⁃tanyl）、戊酰芬太尼（valerylfentanyl）、對-氟丁酰芬太尼［para-fluorobutyrylfentanyl（PFBF）］、4-氟異丁酰芬太尼（4-fluoroisobutyrlfentanyl）、奧芬太尼（ocfentanil）、呋喃芬太尼（furanylfentanyl）、瑞芬太尼（remifentanil）、舒芬太尼（sufentanil）、卡芬太尼（carfentanil）、乙酰芬太尼（acetylfentanyl）、甲氧乙酰芬太尼（methyoxyace⁃tylfentanyl）、環丙基芬太尼（cyclopropylfentanyl）、芬太尼-D5（fentanyl-D5，作爲內標）均購自美國Cerilliant公司。其中芬太尼及阿芬太尼對照品質量濃度爲1mg/mL，其他對照品質量濃度均爲100μg/mL。甲醇、乙腈購自美國Sigma-Aldrich公司，乙酸铵（色譜純）、98%甲酸（優級純）購自瑞士Fluka公司，其他試劑均爲分析純，去離子水由Milli-Q超純水系統制得。
硼砂緩沖溶液：取硼砂適量，置于250mL容量瓶中，加去離子水至刻度，配制pH=9.2的緩沖溶液。
取各化合物對照品適量，用甲醇配制成質量濃度爲2μg/mL的混合對照品溶液。用甲醇逐級稀釋成質量濃度爲1000、200、100、10、1ng/mL的工作液。
取芬太尼-D5適量，加甲醇配制成質量濃度爲10μg/mL的對照品溶液，再用甲醇稀釋成質量濃度爲100ng/mL的工作液。
取抗凝全血樣品100μL置于2mL離心管中，精確加入100ng/mL的芬太尼-D510μL，混合10s，加入硼砂緩沖溶液（pH=9.2）100μL、乙酸乙酯0.7mL，渦旋30s，以9700×g離心5分鍾。取上層有機相置于5mL離心管中，40攝氏度下吹幹。加入流動相A200μL複溶，以1249×g離心5分鍾，取上清液100μL裝入進樣小瓶內襯管中供UPLC-MS/MS分析。
電噴霧離子源采用正離子模式（ESI+），離子噴射電壓5500V，碰撞氣7psi，氣簾氣30psi，霧化氣40psi，輔助氣40psi，離子源溫度爲500℃。采用多反應監測（MRM）模式，選用兩對母離子/子離子進行定性分析，其中響應較高的第一對離子爲定量離子對。
色譜柱爲ACQUITYUPLCHSST3柱（100mm×2.1mm，1.8μm，美國Waters公司），柱溫爲室溫；流動相A爲20mmol每升乙酸铵緩沖溶液（含0.1%甲酸和5%乙腈），流動相B爲乙腈；流速爲0.3mL每分鍾。采用梯度洗脫。進樣量爲5μL。
采用行業公認的方法有效性驗證體系，包括選擇性、檢出限（LOD）、定量限（LOQ）、線性範圍、准確度和精密度。提取回收率和基質效應參考MATUSZEWSKI等提出的方法。
分別對10個不同來源的空白全血樣品按已建立的方法進行分析，考察全血中內源性物質對20種目標物是否有幹擾。
取空白血1.0mL，加入20種目標物的混合對照品工作液，配制成質量濃度爲0.05、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、30.00、40.00ng/mL的全血樣品。取全血樣品100μL，按1.3節方法處理、分析。以每個目標物全血質量濃度爲横坐標（x），目標物與芬太尼-D5的峰面積比值爲縱坐標（y），采用加權（權重系數爲1/x）最小二乘法進行回歸，求得線性方程。以信噪比（S/N）大于3的質量濃度爲LOD，以信噪比（S/N）大于10、精密度相對標准偏差（RSD）小于20%且准確度在80%-120%的質量濃度爲LOQ。
取空白血1.0mL，加入20種目標物的混合對照品工作液，配制成質量濃度爲0.2、0.5、5.0、30.0ng/mL的全血樣品。取全血樣品100μL，每個質量濃度點6份樣品，按所建立的方法進行處理、進樣，計算日內精密度和准確度。連續進樣4天，計算日間精密度和准確度。
選取低（芬太尼爲0.5ng/mL，其他爲0.2ng/mL）、中（5.0ng/mL）、高（30.0ng/mL）3個質量濃度的全血樣品，按1.3節方法處理後進樣的峰面積設爲A，空白樣品按1.3節方法處理後，加入相應質量濃度的對照品溶液進樣後的峰面積設爲B，對照品溶液吹幹複溶後進樣的峰面積設爲C，提取回收率=A/B×100%，基質效應=B/C×100%。
SD大鼠4只，雌雄各2只，體質量190-230克，自尾靜脈注射舒芬太尼，給藥劑量爲10μg每公斤。于給藥後2、5、10、15、30、45、60min以及1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、10.0、12.0、16.0、24.0小時眼眶取血約0.3mL。取血液0.1mL按照1.3節進行前處理，取100μL進樣分析。
本研究比較了不同樣品前處理方法（蛋白沉澱和液液萃取）的回收率。在0.1mL空白全血中添加20種目標物的混合對照品工作液，配置成質量濃度爲5ng/mL的全血樣品，分別用蛋白沉澱和液液萃取法進行前處理。蛋白沉澱法爲0.1mL全血加入0.9mL乙腈，取上清液吹幹後用0.1mL流動相A複溶後進樣；液液萃取法分別考察了乙醚和乙酸乙酯兩種提取溶劑，取0.1mL全血，加入0.1mL硼砂緩沖溶液（pH=9.2），再加入0.7mL乙醚或乙酸乙酯進行提取，提取液吹幹後用0.1mL流動相A複溶後進樣。
全血經乙腈沉澱蛋白後提取回收率爲47.76%-63.64%，經乙醚液液萃取後提取回收率爲54.33%-57.21%，而經乙酸乙酯液液萃取後提取回收率均大于80%。結果表明，用乙酸乙酯液液萃取的提取效率較高。因此本實驗最終選擇乙酸乙酯作爲液液萃取的提取溶劑。
10份空白全血樣品經處理後，內源性物質不幹擾目標物測定。
本方法日內精密度和日間精密度分別爲3.02%-11.92%、4.50%-14.24%，均在±15%之內；准確度爲87.69%-114.68%，均在85%-115%。上述結果表明該方法精密度和准確度良好。
結果表明，各目標物經本方法提取後，提取回收率爲85.35%-101.80%，表明經乙酸乙酯提取後可達到比較滿意的提取效率。基質效應爲79.96%-111.40%，說明本方法無明顯基質影響。
用所建方法檢測注射舒芬太尼後SD大鼠血液中的舒芬太尼。結果顯示，在注射舒芬太尼後2分鍾，大鼠血液中即可檢測出舒芬太尼，平均血藥質量濃度爲1.26ng/mL，說明所建方法適用于實際樣品中舒芬太尼的檢測分析。大鼠血液中舒芬太尼質量濃度峰值出現在注射後5-10分鍾，平均血藥質量濃度爲1.72ng/mL。注射後10小時在大鼠血液中仍能檢測出舒芬太尼，12小時之後大鼠血液中舒芬太尼質量濃度低于LOD。舒芬太尼注射後起效快，持續時間較芬太尼長，與文獻報道相符。
本研究建立了UPLC-MS/MS法同時測定全血中20種芬太尼類似物，在8分鍾內完成了對各化合物的分析測定。該方法前處理簡單、靈敏度高、選擇性好，適用于實際樣品的檢測分析。運用所建方法檢測注射舒芬太尼後SD大鼠血液中的舒芬太尼，注射後10小時在大鼠血液中仍能檢測出舒芬太尼。
來源：法醫學雜志2019年8月第35卷第4期